DMP法測定漆酶酶活
A.1 原理
漆酶能氧化DMP為3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌,該產(chǎn)物在470nm處有最大吸收峰,其消光系數為49.6 mmol-1Lcm-1,在一定濃度范圍內該產(chǎn)物濃度與其吸光度值成線(xiàn)性關(guān)系,通過(guò)測定吸光度的變化值來(lái)計算產(chǎn)物的生成速率,酶活的定義為在一定條件下,每分鐘氧化1 umol DMP或生成1umol 3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位。
A.2.1 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.5)
稱(chēng)取檸檬酸14.71g,用水準確稀釋至700ml,稱(chēng)取磷酸氫二鈉14.33g,用水溶解并準確稀釋至200 mL。將檸檬酸溶液加入到磷酸氫二鈉溶液中,邊加邊攪拌并調pH至3.5。
A.2 .2 DMP
稱(chēng)取DMP0.154g,用水溶解并定容至100mL。
A.3 儀器和設備
可見(jiàn)分光光度計
分析天平:精度為±0.0001g。
pH計:精度為±0.01 pH單位。
恒溫水?。壕?plusmn;0.2℃
A.4 步驟
漆酶酶活測定以DMP為底物,每3ml反應體系含:2.4ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.5),0.5ml DMP,60 ℃保溫5 min,加入0.1ml(稀釋適當倍數的)酶液,同時(shí)按下秒表計時(shí),在470 nm處用可見(jiàn)分光光度計在0s時(shí)記錄一次吸光度值,記為X0,間隔60s再記錄一次吸光值,記為X60。
固體酶制劑測酶活預處理:稱(chēng)取0.1g固體粉末,加1ml去離子水溶解,待充分溶解后8000rpm離心5min,取上清按上述方法測其酶活。測得酶活單位為U/ml,換算成固體酶制劑的酶活還需乘以系數10,酶活單位為U/g。
A.5 計算結果
E= ×n×7.258 …………………………………(A.1)
式中:
E:酶活力,U/ml
X60:60s時(shí)記錄的吸光度值
X0:0s時(shí)記錄的吸光度值
n:稀釋倍數
A.6 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對值不應超過(guò)平均值的3%。
此方法僅作為參考,具體環(huán)境不同,相應的也會(huì )有所不同!
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